核酸检测（NAT）试剂产品技术工艺发展分析(可研报告范文)

第一节 基本生产技术、工艺或流程

1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着NAT的诞生。随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。

1、PCR扩增方法

PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。

目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,进一步提高了检测的敏感性和特异性。若加入已知浓度的内标或外标,便能进行定量检测。由于该方法实现了反应体系的全封闭和操作的全自动,不仅减少了污染,还提高了效率。

虽然国内许多生物技术企业已经利用荧光PCR方法开发出成熟的NAT定量检测产品,如深圳匹基、广州达安、上海复星、上海科华、上海浩源等,但这些产品均只获得我国食品和药品监督部门的临床诊断使用许可证。而临床诊断和血液筛检是2个不同的应用领域, 血液筛检对试剂的要求要比临床诊断高很多。迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛检的试剂仅有2种,即Roche COBAS Ampli Screen HBV/HCV/HIV和 HIV 1/HCV检测系统,FDA评判这些试剂是否能用于血液筛检的标准之一: 必须对50copies/ml的病毒核酸的检出率>95%。相当一部分国产荧光定量PCR检测试剂或许能在某些标本上获得20copies/ml的灵敏度,但一般都很难满足95%检出低病毒载量标本的要求。相信不断提高检测灵敏度,早日研发并注册成功我国自己的NAT血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的发展目标。

2、转录介导的扩增方法 

包括转录介导的扩增系统(transcription mediated amplification,TMA)和核酸序列依赖扩增系统(nucleic acidｓsequence based amplification,　NASBA)。TMA是一种利用Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶和T7 RNA多聚酶2种酶的共同作用,在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统,主要扩增原理为: 目标序列在逆转录酶作用下,以引物为引导进行逆转录, 逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后,合成双链的DNA,并在T7 RNA多聚酶作用下,转录出成千上万个目标RNA序列,这些RNA又可以作为模板进行下一个循环,整个反应是一个自催化过程。NASBA的原理与TMA相似,只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。这两种方法的特异性强,灵敏度高,反应条件简单,扩增效率高,无需专门的扩增仪器,且因整个反应在1个试管中进行,也减少了污染。

3、其它NAT技术

包括支链DNA检测技术(branched DNA signal amplification assay,bDNA)、环介导的等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、连接酶链技术(ligase chain reaction, LCR)和链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)等。这些技术或因为自身原因,或因为刚研发出来尚未进入临床,均未在血液筛检中应用。如bDNA技术，在1995年左右推出,其信号放大是通过碱性磷酸酶(AP)标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。bDNA技术对待测DNA无扩增,特异性较好,能进行病毒定量检测,动态地揭示病毒滴度水平的变化,不仅在预测干扰素疗效方面可为临床提供更为有用的信息,还可作为丙肝病人对干扰素完全应答的标志反应。但也正因为bDNA技术没有扩增待测核酸,其检测灵敏度远远低于PCR,故该项技术实际上不适合用于血液筛检,目前国内主要将bDNA技术用于HBV或HCV病毒滴度的定量 分析 。

第二节 新技术研发、应用情况

我国有关NAT血液筛检 研究 的报道还比较少见。比较规范的血液筛检 研究 更少，有的单位利用国产PCR试剂加电泳检测的方法进行检测，其实验室交叉污染的问题很难控制。

国内血液中心开展NAT检测 研究 的情况

国内原料浆开展NAT检测 研究 情况

第三节 国外技术发展现状

NAT是一种新兴的检测方法,许多国家及输血机构都进行了一系列的 研究 ,在国外特别是一些发达国家和地区已普遍应用于血液筛检[12]，例如,日本是世界上最早在全国范围内对血液进行HBV、HCV、HIV NAT筛检的国家[13],新加坡、中国香港也已经分别采用不同的方式对血液进行NAT筛检; 德国和荷兰从1997年起就开始NAT筛检的尝试,英国和法国的部分血站也从2000年起开始了NAT血液筛检; 美国则从1999年3月开始在FDA新药审核程序下使用不同的试剂进行常规血液筛检。

日本使用的方法为罗氏公司与日本红十字会共同开发的全自动的Ampli NATＴＭ NPX系统（为荧光PCR技术，可同时联合检测HBV,HCV和HIV），目前正在考虑使用Chiron公司的TMA技术;美国ARC和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技术;美国血液中心(ABC)系统则使用罗氏COBAS Ampli Screen; 荷兰及部分欧洲国家将荷兰阿克苏公司推出的 

Nucliesens全自动核酸提取方法同罗氏的COBAS Ampli Screen扩增体系结合起来使用;而英国和法国的部分血站在2000年采用的是Qiagen的全自动核酸提取系统与罗氏的COBAS Ampli Screen扩增体系结合起来的方法, 随后部分血站又更换成Chiron的TMA技术。各血站根据自身特色, 正在对各种不同的技术组合进行评估, 目的是寻求一种最适合的NAT技术,既保障血液安全,又能保证血液的及时供给,还要做到省时省力。

第四节 技术开发热点、难点 分析

核酸扩增技术以其敏感、特异、快速、简便向人们充分展示了其在结核病临床诊断中的巨大优越性。Amplicor PCR和AMTDT已在国外临床微生物学实验室普遍开展应用，并取得了令人满意的效果。由PCR衍生的几种新的分子诊断技术(LCR、SDA、QB复制酶扩增法等)正逐步由实验室过渡到临床。核酸扩增技术是一种新兴的发展中的诊断技术，在不少方面仍有待改进与完善，如方法学上进一步自动化、简单化，优化实验条件与参数，不断改进检测手段，拓宽应用范围(分支杆菌菌型鉴定、药敏试验、化疗效果的监测等)，开发更为实用的标准化试剂盒等。随着分子生物学的不断发展，相信该技术不久将成为诊断结核病的常规方法。

第五节 技术未来发展趋势 分析

最近几年,NAT血液检测筛选系统已经成功应用于全球范围内血库及输血中心的血液样本中的病毒检测。许多国家（地区）现在仅使用经NAT测试显示HCV RNA为阴性的血液用于病人输血。在另一些国家（地区）,还要求针对其它病毒的测试(即HIV, HBV, parvovirus B19,HAV)。当前的NAT测试系统通常用于测试来自16~96位供血者的集体血样。当前,机构内部自我改进的NAT系统被广泛使用,因为它们具有比商业系统更了不起的敏感性、灵活性、高通量及低成本。结合自动化的核酸提取系统,譬如NucliSens 或BioRobot, 结合自动化的扩增及检测系统,譬如COBAS Amplicor, AmpliScreen 或TaqMan 检验,数个国家（地区）血液服务中心开发了完全自动化的NAT系统。随着NAT 技术进展，在将来有可能实现由集体血样NAT向单个血样NAT的转变，以及整合多种病毒或包括寄生虫和细菌的其它病原体的检测。或许更为重要的意义在于,利用已有的NAT技术定期进行血库审查，可以迅速引入对将来可能出现的新型病原体的筛选检测，从而防止类似二十年前发生的由输血导致的HIV传染。


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